了解基因调控区域(开启和关闭基因的 DNA 和 RNA 部分)中特定突变的影响对于阐明基因组的工作方式以及正常发育和疾病非常重要。但是以系统的方式研究这些调控区域中的大量突变是一项艰巨的任务。虽然在细胞系和酵母方面取得了进展，但对活体动物的研究很少，尤其是在大群体中。

亥姆霍兹协会 (MDC) 的 Max Delbrück 分子医学中心的实验和计算生物学家联手建立了一种方法，可以在多达 100 万条微观蠕虫中诱导数千种不同的突变，并分析由此产生的对蠕虫身体特征的影响和功能。

“对于细胞系，你缺少发育过程、许多细胞类型，以及所有影响基因调控的细胞类型之间的相互作用，”博士 Jonathan Froehlich 说。柏林医学系统生物学研究所 (BIMSB) 的 MDC 基因调控元件系统生物学实验室的候选人和共同第一论文作者。“我们现在可以在重要的环境中测试这些调节序列，并观察它们对生物体的影响。”

微小的秀丽隐杆线虫蠕虫是研究人类基因调控过程的绝佳代表。“我们与他们非常相似，”Froehlich 说。“它们有专门的组织、肌肉、神经、皮肤、肠道、生殖系统。对于基因调控研究，重要的是你有专门的细胞类型和发育。”

为了在大型秀丽隐杆线虫种群中有效诱导各种突变，研究人员求助于基因编辑工具 CRISPR-Cas9。他们鉴定了多达 10 个要被 Cas9 酶切割的 DNA 片段，Cas9 酶被 RNA 引导到这些点。但研究人员没有发送任何其他指令，让生物体通过自然机制修复 DNA 断裂。这导致以遗传密码缺失或插入形式出现的各种突变，称为“插入缺失”。

通常在基因组编辑领域，科学家们希望非常精确地了解一个突变将如何影响一个系统。在这个旨在同时观察各种突变的实验设置中并非如此。

“其中一部分是受控的，我们设计引导 RNA 并告诉 Cas9 核酸酶去哪里的部分，但其结果是半随机的，”Froehlich 说。“你会有许多不同类型的结果，我们可以看到对动物的影响。”

值得注意的是，研究人员只需要操纵线虫的亲代。他们为父母添加了 Cas9 系统;当蠕虫暴露在高温下两个小时时，酶开始工作，切割生殖生殖细胞中的 DNA。然后雌雄同体的蠕虫繁殖，产生了数千个含有各种突变的后代。无需一一修改蠕虫的基因组。

为了在数十万条蠕虫中识别由此产生的突变，该团队使用了多种基因组测序技术，产生了大量数据。为了有效地分析它，他们与 MDC 的生物信息学和组学数据科学平台合作。

生物信息学科学家 Bora Uyar 博士首先寻找可以帮助回答必要问题的现有工具，例如：Cas9 系统是否被激活，DNA 的目标区域是否被切割，哪些序列对基因组功能很重要?“我尝试了现有的工具，但没有一个旨在解决具有如此广泛的数据类型和大量突变的这些问题，并产生我们最终想要的交互式数据可视化，”Uyar 说。

因此，他开始着手设计一个新的软件包，称为crispr-DART——下游分析和报告工具的缩写。这是对并行编辑方法的致敬，它不是 100% 受控的，因此并不总是导致目标区域发生突变。“这就是为什么我称它为crispr-DART，你在基因组中投掷一些箭头，该工具会告诉你你是否真的成功，”Uyar 说。

该软件是公开可用的，可以处理各种不同的测序数据类型——长读、短读、单读、配对读、DNA、RNA。该系统快速处理样本，即使在混合中添加了新类型的信息，也有助于识别有趣的发现，例如协议的效率以及突变与对照的比较。

“crispr-DART 遵循我们在其他管道中使用的原则，其中可重复性、可用性和信息报告是非常重要的组成部分，”MDC 的生物信息学和组学数据科学平台负责人 Altuna Akalin 博士说。

惊喜发现

使用新协议，该团队能够将调节区域中的几个突变与特定的生理效应联系起来。他们还得到了一个意想不到的发现。长期以来，人们一直认为 lin-41 基因中的两个 microRNA 结合位点共同作用来控制基因表达。使用他们的并行编辑系统，该团队在一个或另一个位点诱导突变，然后在两个位点一起诱导突变。只要一处完好，蠕虫就能正常发育。但如果两个位点都发生突变，基因表达将继续不受调控，蠕虫就不能正常发育并死亡。

“这很好地展示了该系统如何用于研究发育过程中的基因调控，”负责该项目的 MDC 柏林医学系统生物学研究所 (BIMSB) 科学主任 Nikolaus Rajewsky 教授说。“我们期待将这种并行基因组编辑方法应用于更多问题。”

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标签： 微小蠕虫基因组编辑